怎樣設計引物?
1樓:網友
至於設計引物的一般原則如下:
序列選取應在基因的保守區段。
避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對,避免引物自身形成環狀髮卡結構。
典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長,保證序列獨特性,並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。
較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交,降低了特異性,而且比短序列雜交慢,從而降低了產量。
tm值在55-65℃(因為60℃核酸外切酶活性最高),gc含量在40%-60%
引物之間的tm相差避免超過2℃
引物的3』端避免使用鹼基a,引物的3』端避免出現3個或3個以上連續相同的鹼基。
為避免的擴增,引物設計最好能跨兩個外顯子。
taqman探針pcr要求片段長度在80bp-150bp
引物末端(最後5個核苷酸)不能有超過2個的g和c。
引物設計的引物設計原則
2樓:諾諾百科
1、引物長度一般為15-30bp,常用的為18-27bp,但不能大於38bp;
2、引物gc含量一般為40%-60%,以45-55%為宜,上下游引物gc含量和tm值要保持接近;
3、引物所對應的模板序列的tm值最好在72℃左右,至少要在55-80℃之間,tm值曲線以選取72度附近為佳,5'到 3』的下降形狀也有利於引物與模板的結合;
4、引物之間:兩個引物之間不應有多於4個的互補或同源鹼基,不然會形成引物二聚體,尤應避免3』端的互補重疊。
3樓:網友
1、長度:15—30bp,其有效長度[ln=2(g十c)十(a十t)]一般不大於38,否則pcr的最適延伸溫度會超過taq酶的最佳作用溫度(74度),從而降低產物的特異性。
2、g十c含量:應在40%一60%之間,pcr擴增中的復性溫度一般較tm值低等於引物的tm值減去5—10度。引物長度小於20時,其tm恆等於4×(g十c)十2×(a十t)。
3、鹼基分佈的隨機性:應避免連續出現4個以上的單一鹼基。尤其是不應在其3』端出現超過3個的連續g或c,否則會使引物在g十c富集序列區錯誤引發。
4、引物自身:不能含有自身互補序列,否則會形成髮夾樣二級結構。
5、引物之間:兩個引物之間不應有多於4個的互補或同源鹼基,不然會形成引物二聚體,尤應避免3』端的互補重疊。
6、上下游引物的互補性:乙個引物的3『末端序列不允許結合到另乙個引物的任何位點上。
末端:如果可能的話,每個引物的3『末端鹼基應為g或c。
8、引物應當超出限制性內切酶識別位點至少3個核苷酸。
如何設計引物?
4樓:鮮活且善良丶桃花
2.在框中貼上入你的原始序列(要比你要擴的目的片段兩端延伸一點)
3.在框的下方有許多可以設定的限制條件,如片段長度,一定包含的片段位置,引物長度,引物退火溫度等,你可以進行設定。
同時引物設計和選擇目的dna序列區域時可遵循下列原則:
1) 引物長度約為16-30bp,太短會降低退火溫度影響引物與模板配對,從而使非特異性增高。太長則比較浪費,且難以合成。
2) 引物中g+c含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 tm=4(g+c)+2(a+t).
3) 四種鹼基應隨機分佈,在3'端不存在連續3個g或c,因這樣易導致錯誤引發。
4) 引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應,以減少由於密碼子擺動產生的不配對。
5) 在引物內,尤其在3'端應不存在二級結構。
兩引物之間尤其在3'端不能互補,以防出現引物二聚體,減少產量。兩引物間最好不存在4個連續鹼基的同源性或互補性。
7) 引物5'端對擴增特異性影響不大,可在引物設計時加上限制酶位點、核糖體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、螢光素、地高辛等。通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個保護鹼基。
引物不與模板結合位點以外的序列互補。所擴增產物本身無穩定的二級結構,以免產生非特異性擴增,影響產量。
9) 簡併引物應選用簡併程度低的密碼子,例如選用只有一種密碼子的met,3'端應不存在簡併性。否則可能由於產量低而看不見擴增產物。
如何設計引物
5樓:網友
1、引物的長度一般為15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不應大於38,因為過長會導致其延伸溫度大於74℃,不適於taq dna聚合酶進行反應。
2、 引物序列在模板內應當沒有相似性較高,尤其是3』端相似性較高的序列,否則容易導致錯配。引物3』端出現3個以上的連續鹼基,如ggg或ccc,也會使錯誤引發機率增加。
3、引物3』端的末位鹼基對taq酶的dna合成效率有較大的影響。不同的末位鹼基在錯配位置導致不同的擴增效率,末位鹼基為a的錯配效率明顯高於其他3個鹼基,因此應當避免在引物的3』端使用鹼基a。
引物設計原則是什麼?引物設計的引物設計原則
一 引物設計有3條基本原則 1 引物與模板的序列要緊密互補。2 引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構。3 再次引物不能在模板的非目的位點引發dna聚合反應 即錯配 二 pcr引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段,使其能有效地擴增模板dna序列。如前述,引物的優劣直接關係到pcr的特異性與...
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多看,多練,多想。多看別人好的作品,看到好的作品就練習,臨摹,原創,都ok。多想,為什麼別人的這個作品這麼好,好再 我自己能不能做到,如果不能做到,怎樣才能做到 有個好的老師,比什麼都好,網上的教程一說就一大堆,就像紙上談兵一樣 有關於網頁設計方面的書,買來看看吧,我也對這方面有興趣,但是沒時間。怎...