1樓：學會踩離合
雙酶切反應 (double digests)
1、同步雙酶切 同步雙酶切是一種省時省力的常用方法。選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩衝液是非常重要的一步。neb每一種酶都隨酶提供相應的最佳nebuffer，以保證100%的酶活性。
nebuffer的組成及內切酶在不同緩衝液中的活性見《內切酶在不同緩衝液裡的活性表》及每支酶的說明書。能在最大程度上保證兩種酶活性的緩衝液即可用於雙酶切。由於內切酶在非最佳緩衝液條件下的切割速率會減緩，因此使用時可根據每種酶在非最優緩衝液中的具體活性相應調整酶量和反應時間。
2、分步酶切 如果找不到一種可以同時適合兩種酶的緩衝液，就只能採用分步酶切。分步酶切應從反應要求鹽濃度低的酶開始，酶切完畢後再調整鹽濃度直至滿足第二種酶的要求，然後加入第二種酶完成雙酶切反應。
3、使用配有特殊緩衝液的酶進行雙酶切（圖） 使用配有特殊緩衝液的酶進行雙酶切也不復雜。在大多數情況下，採用標準緩衝液的酶也能在這些特殊緩衝液中進行酶切。這保證了對緩衝液有特殊要求的酶也能良好工作。
由於內切酶在非最佳緩衝液中進行酶切反應時，反應速度會減緩，因此需要增加酶量或延長反應時間。通過《內切酶在不同緩衝液裡的活性表》可檢視第二種酶在特殊緩衝液相應鹽濃度下的作用活性。
雙酶切建議緩衝液。
注： 只要其中一種酶需要新增bsa，則應在雙酶切反應體系中加入不會影響任何內切酶的活性。
注意將甘油的終濃度控制在10%以下，以避免出現星號活性，詳見《星號活性》。可通過增加反應體系的總體積的方法實現這一要求。 某些內切酶的組合不能採用同步雙酶切法，只能採用分步法進行雙酶切。
上表中這些組合以「seq」標註。
兩種酶的反應緩衝液不一樣，做雙酶切時如何處理？
2樓：教育小百科是我
如果是分開酶切的話，第一個酶切完成後要**（可用醇**，效率比較高）後，再進行第二次酶切。
做轉化的時候，進行酶連線反應時，注意保持低溫狀態，因為ligase酶很容易降解。為保險起見，一般連線3小時，16度；對含有amp-resistence的質粒鋪板時，注意加amp時的溫度，溫度過高，會使克隆株無法篩選出來。
3樓：黯夜暴走
沒有公用buffer的話，比較麻煩，你只有先做個單切，然後再**回來，再用另外一種酶切下。也就是所說的分步酶切。除此之外沒有其他任何辦法！
你用的是哪個公司的酶？一般該公司都會出個酶的buffer表的。你依據那個表查就可以了，如果你是用neb的酶，告訴我酶切位點我可以幫你查下。
takara的也行！
4樓：士誠小人也
查一下各自在不同buffer中的活性，儘量選擇雙方都有高活性的buffer
雙酶切沒有通用緩衝液是不是單酶切
5樓：媽咪愛
你是不是要把雙酶切後的質粒與載體連線，而無論是pcr還是載體都無法通過電泳判斷是否酶切完全，所以不好進行連線呀？對於pcr產物一般會採取這樣的策略，將產物首先連線到t載體上，然後再用設計好的雙酶切，電泳**切下的條帶，這樣就能確保得到的是完全酶切的產物。載體判斷比較麻煩，要看載體本身、多大雙酶切為點之間的條帶有多大、雙切前後的大小是否能通過電泳區別出來，但是雙切位點一般都在標記基因裡面，所以插入片段的載體會在後期轉化可以後區分開，所以也沒有太大必要確定他是否完全，只要充分酶切就好了。
︰ûêµñé¼¼êõ bsaµäðôöêóë×÷óãêçê²ã´£¿
pcr產物沒有純化能夠直接進行雙酶切嗎
6樓：匿名使用者
pcr產物經pcr純化試劑盒純化後，可以做ecori和bamhi的雙酶切。酶切、純化都可以用pcr純化試劑盒完成，只有一種情況例外，pcr模板為質粒，且這個質粒和要用的載體有相同的抗性。此時需要跑一次膠來丟掉模板質粒，否則在連線產物轉化的平板上長出的菌落許多是模板質粒，而不是你所構建的質粒。
pcr產物不經純化也可以直接酶切，但也很麻煩，效果可能不會很好，可能需要新增其他東西（亞精胺，限制性內切酶緩衝液，bsa等）來完成酶切。
7樓：晨光眠夏
不可以。
首先，採用的是質粒模板；
其次，擴增得到的非單一條帶，如果不純化直接酶切，那麼得到的將是帶有相應酶切位點的幾種片段，繼續試驗的話，菌落pcr鑑定時可能會出現幾種不同大小的條帶。
第三、pcr產物裡面緩衝液並不是合適的酶切緩衝液，會極大的影響酶切的效率。甚至於根本就切不開，即便是隔夜酶切也不可以。
酶切技術的雙酶切
takara的nhei 和bamhi雙酶切體系表中沒有雙酶切緩衝體系應該如何選用緩衝液呢？
8樓：匿名使用者
1、如果你用的是takara的酶，應該就只能分步了，而且bamhi還是30度反應，雖然也可以在37度切，但如果是分步切的話還是用30度吧。
2、為什麼不用neb的酶呢？可以用buffer1或2同時切（好像是，你需要自己再確認下），而且neb的這兩種酶都有hf酶，效率更高，都可以在buffer4中達到100%的效率。
以上，僅供參考~希望有幫助！
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