1樓：匿名使用者
首先過短的pcr產物純化困難，一般的pcr產物純化試劑盒都要求pcr產物片段大於150bp，過短的 pcr產物純化和準確定量都非常困難。因此我們要求用於測序的pcr產物一般不低於150bp長度。其次，由於測序技術本身的限制，測序反應對環境的干擾比較敏感，模板太短的pcr測序受外界的 干擾更大，很容易造成測序失敗。
--------**三博遠志**(測序faq)
2樓：南霧嶺後
目前用的測序儀一般是基於pcr方法的sanger法原理，那麼用你的pcr產物為模板，測序引物從最兩端開始，麼測序時由於測序儀的毛細電泳管解析度問題，測序引物後的50個左右長度鹼基測不出。
測序儀通常從測序引物起延伸50個左右bp後，才能分辨，讀出序列。
當然，如果你用第三代或***測序技術， 稱為next generation dna sequencing 或next next generation dna sequencing，那麼再短的pcr產物也能測出來。這種新的測序方法通常最長也就是測50到60bp。
3樓：寒風斷雪
這裡有兩個問題，pcr產物測序和pcr過短的問題熟悉pcr產物測序原理就明白，前面20-30個bp測出來市資料是不準確的，測序範圍大概是800左右，超過的需要雙向測序。
過短的pcr產物，pcr測序肯定需要純化的，如果太短的話，在膠**的時候很可能影響pcr產物濃度。一般pcr送樣測序的條件a未純化pcr產物的要求，1. 片段大於200bp；2.
請提供50ul pcr擴增產物(總量1ug-2ug)；3.取3ul樣品，應該能夠清晰的分辨出目的條帶； 自帶引物，引物濃度不低於5um,並請註明。b純化後pcr產物的要求1.
pcr產物溶於蒸餾水中(請勿溶解在te溶液中)；
2.濃度大於20ng/ul，體積大於10ul，長片段需適當增加量；3.電泳檢測條帶專一； 自帶引物
**都不是很貴，一般能22-25元一次。
為什麼送去測序的片段要通過菌液，而不是直接拿pcr去測序？
4樓：匿名使用者
由於測序的儀器敏感度等原因，每家測序的要求不一樣，收費也不一樣。
一般來說，測序的樣本可以是pcr產物，也可以是質粒。樓上說的有一定道理，但不是不能用pcr產物測序的理由。
要求你提供菌液，是因為他們的測序反應體系對質粒的溶液比較敏感，比如對edta，鹽溶液的濃度等，所以乾脆他們自己來提質粒。pcr產物也類似。他們不清楚你是如何做pcr的，也就不知道反應物當中有沒有會抑制測序的成分。
5樓：隙痕零落
1）pcr產物可能有多條帶（錯配產生，但大小一樣），將其匯入大腸桿菌後，產生的單克隆一般只接受一個目的條帶，通過重複，就可以在一定程度上排除錯配造成的誤差。且大腸桿菌複製的錯配率遠遠低於pcr過程中的錯配。
2）測序反應一開始時不穩定，講目的條帶匯入載體中，由於載體的序列保守且已知，一開始的測序反應從載體的序列開始測可以保證目的條帶測序的相對準確性。
請問pcr產物直接測序和克隆後再測序有什麼區別，用pcr產物直接測序不是更省時間嗎，省得再連到載體上了啊
6樓：那影子是我
pcr直接測序會存在或多或少的套峰，所以通常都採用雙向引物測序，通過鹼基互補原則來彌補單向沒測出來的地方。克隆後測序就非常準確了，而且有時候pcr跑出來有雜帶的話就必須克隆後再拿去測序了。我也涉入分子不久，希望回答能幫到你。
7樓：士誠小人也
pcr產物直接測序，引物端約有幾十個鹼基是測不出來的，如果你恰好關注這個位置，那麼或者從另一端測通（你的產物不長），或者克隆測序
此外，很多時候由於pcr產物不專一，直接測序效果不好，而克隆測序沒這個問題，測序效果好於pcr產物測序。不過，如果你使用普通taq酶，pcr過程中會引入錯誤，用產物直接測序會掩蓋這些錯誤，但克隆測序時則會保留這些錯誤。
為什麼質粒和pcr產物需要拿去測序啊
8樓：最強大腦花
質粒和pcr產物需要拿去測序有2個目的，一是驗證插入序列的dna序列是否無誤。第二是看插入的方向和位置是否正確。如果做定量pcr用到質粒的話，一般是用來做標準曲線的。
聚合酶鏈式反應是一種用於放大擴增特定的dn**段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊dna複製，pcr的最大特點，是能將微量的dna大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前**案中**所遺留的毛髮、**或血液，只要能分離出一丁點的dna，就能用pcr加以放大，進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。
由2023年美國mullis首先提出設想，2023年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易dna擴增法，意味著pcr技術的真正誕生。到如今2023年，pcr已發展到第三代技術。1973 年，臺籍科學家錢嘉韻，發現了穩定的taq dna聚合酶，為pcr技術發展也做出了基礎性貢獻。
pcr(聚合酶鏈式反應）是利用dna在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°c左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至dna聚合酶最適反應溫度（72°c左右），dna聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基於聚合酶製造的pcr儀實際就是一個溫控裝置，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。
9樓：
質粒如果需要測序，說明你們實驗室對這個質粒中插入的基因序列不清楚，需要通過測序知道其中到底是什麼基因，絕大多數情況下是做了克隆之後需要去確認插入到目的載體中的序列是不是正確，這樣才能進行下一步的實驗。pcr產物測序一般是為了確認pcr產物序列的正確，因為pcr過程中有可能會發生突變或者其他導致序列改變的情況，只有確認之後才能進行後續實驗。
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