1樓：濤濤濤
使用說明書，看了嗎？trizol，我用的少，我用的比較多的是typhon（往聖的）。給你發個typhon的說明書吧。
oneshine typhon total rna extraction reagent 總rna提取試劑是一種可以用於動物、植物、微生物、病毒總rna抽提的試劑，具有極強的細胞或病毒顆粒裂解能力，可在短時間內裂解各種生命形式的基本單位。本品含有能夠有效抑制rnase的有機試劑，最大限度地減少總rna的降解。用本產品提取的總rna純度高，不含基因組dna，可以直接用於northern blotting、斑點雜交、mrna純化、體外翻譯、rt-pcr、poly(a)+選擇、rna酶保護分析以及構建cdna文庫等多種分子生物學實驗。
經過本產品處理後，離心管中的液體分為三層，rna在上層水相中，而中間層固體相和下層有機相中則分別包含dna和蛋白質。因此可以對中間層和下層進行深度處理，以求獲得總dna和總蛋白；dna的獲取用乙醇沉澱即可，而蛋白質的獲取則採用異丙醇沉澱法。
本產品操作簡便快捷，可以在一小時內完成所有實驗。
ii運輸與儲存方法
採用冰袋運輸4℃避光儲存，有效期一年。儲存時應封口密閉，不宜長時間暴露於空氣中，以免產品遭到氧化而失效。
iii注意事項
1．本產品中含有苯酚、β-巰基乙醇等有毒試劑，具有毒性和腐蝕性，操作時要做好保護措施並在通風櫥內進行取用，不可掉以輕心。如果不慎接觸**或粘膜，應立即轉移至通風場地並用大量的自來水沖洗或漱洗，必要時及時就醫。
2．需自備氯仿、異丙醇、75%乙醇、depc處理水等（本公司均有售），所有吸頭、離心管、pcr管、玻璃容器等要用depc水處理或高溫烘烤後才能使用，防止rnase對總rna的降解（本公司均有售）。
3．樣品用total rna extraction reagent勻漿後，如果不加入氯仿進行下游實驗，先-70℃凍存，可儲存一個月以上。建議抽提總rna後儘快進行後續實驗，短暫儲存應放置在-70℃中，只能凍融一次。
4．過多的樣本量可能會導致裂解不充分，使產物純度降低和汙染。在吸取上清液時，不可貪多和焦急，吸取後所剩上清液的液麵距中間層至少有2mm以上，以免吸取到中間層導致dna的汙染，使後續實驗出現假陽性。
v操作流程
rna的提取
準備試劑
氯仿，異丙醇，75%乙醇，無rnase的水或0.5%sds(溶液均需用depc處理過的水配製)。
操作步驟
1．勻漿處理
a、組織:將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml typhon；肝臟、腦等柔軟組織用勻漿儀進行勻漿處理。然後加入1mltyphon，反覆輕柔吹打，直至溶液不抽絲，樣品體積不應超過typhon體積10%。
b、單層培養細胞:去除細胞培養基，pbs沖洗一次，直接在培養板中加入typhon裂解細胞，每250px2面積加1ml，用移液器吸打幾次，轉移至1.5ml離心管，反覆吹打，直至溶液不抽絲。
typhon的用量應根據培養板面積而定。typhon加量不足可能導致提取的rna有dna汙染。
c、細胞懸液:離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml typhon，反覆吸打直至溶液不抽絲。加typhon之前不要洗滌細胞以免mrna降解。
一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白複合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可於2-8℃ 12000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜，多糖，高分子量dna，上清中含有rna。
處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除，取澄清的勻漿液進行下一步操作。
4．第一步每使用1ml typhon加入0.2ml氯仿，輕柔振盪或吹吸15秒，室溫放置3分鐘。
5．2-8℃ 12000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色或淡黃色水相，中間為固相。rna主要在水相中，水相體積約為所用typhon試劑的60%。
6．把水相轉移到新管中（如要分離dna和蛋白質可保留有機相），用異丙醇沉澱水相中的rna。每使用1ml typhon加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
7．2-8℃ 10000×g離心10分鐘，離心前看不出rna沉澱，離心後在管側和管底出現膠狀沉澱。移去上清。
8．用75%乙醇洗滌rna沉澱。每使用1ml typhon至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。
9．室溫放置乾燥或真空抽乾rna沉澱，不要晾得過幹，否則不易溶解，大約晾5-10分鐘。加入25-200μl無rnase的水或0.5%sds（本公司均有售），用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使rna溶解。
如rna用於酶切反應，勿使用sds溶液。rna也可用100%的去離子甲醯胺溶解。-70℃儲存。
rna的提取注意事項
1．從少量樣品（1-10mg組織或102-104細胞）中提取rna是可加入少許糖原以促進rna沉澱。例如加800μl typhon勻漿樣品，離心取上清液後，異丙醇沉澱rna前加5-10ug rnase-free糖原。糖原會與rna一同沉澱出來，糖原濃度不高於4mg/ml不影響第一鏈的合成，也不影響pcr反應。
2．勻漿後加入typhon，加氯仿之前樣品可在-60—-70℃儲存至少一個月。rna沉澱可儲存在75%酒精中2-8℃一個星期以上或-5—-20℃一年以上。
3．分層和rna沉澱時也可使用低速臺式離心機，2600×g離心30-60分鐘。
rna的提取常見問題分析
得率低：
a.樣品裂解或勻漿處理不徹底
b．rna沉澱未完全溶解
a260/a280<1.65：
a.檢測吸光度時，rna樣品沒有溶於水，而溶於了te中。低離子濃度和低ph值條件下a280值偏高。
b.樣品勻漿時加的試劑量太少。
c.勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘。
d.吸取水相時混了有機相。
e.rna沉澱未完全溶解。
rna降解：
a.組織取出後沒有馬上處理或冷凍
b.待提取rna的樣品沒有儲存於-60至-70℃,而儲存在了-5至-20℃
c.細胞在胰酶處理時過度
d.溶液或離心管未經rnase去除處理
e.電泳時使用的甲醛ph值低於了3.5
dna汙染:
a.樣品勻漿時加的試劑量太少
b.樣品中含有有機溶劑(如乙醇,dmso等),強緩衝液或鹼性溶液
蛋白聚糖和多糖汙染:
沉澱rna的過程中作以下改進可去除這些汙染，步驟7中,每使用1mltyphon在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液(0.
8m檸檬酸鈉和1.2mnacl)混合離心,按之前操作進行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉澱出純rna。
從含有大量多糖的植物中提取rna時應在勻漿後離心，加入以上操作步驟。
dna的分離
準備試劑
乙醇、0.1m檸檬酸鈉(含10%乙醇)、75%乙醇、8mm naoh
操作步驟
1．樣品加氯仿分層後,移去上層水相,用乙醇沉澱中間層和有機相中的dna。每使用1mltyphon加0.3ml無水乙醇混勻，室溫放置3分鐘，2-8℃不超過2000×g離心5分鐘。
2．移去上清，（如需要分離蛋白質，可保留，進一步操作見後）用含10%乙醇的0.1m檸檬酸鈉洗滌dna沉澱。每用1mltyphon加入1ml檸檬酸鈉，室溫放置30分鐘，2-8℃2000×g離心5分鐘，棄上清，重複一次。
3．用75%乙醇再洗一遍dna沉澱，每使用1mltyphon加入1.5-2ml75%乙醇,室溫放置10-20分鐘(不時顛倒混合)2-8℃2000×g離心5分鐘,棄上清。
4．室溫放置晾乾dna5-15分鐘，用8mmnaoh溶解dna。從50-70mg組織或10細胞中分離的dna溶於300-600μl8mmnaoh，dna的濃度通常為0.2-0.
3μg/μl。提取的dna沉澱不易溶於水和tris緩衝液中，建議用弱鹼溶解，8mmnaoh的ph值為9，溶解dna後可用te、hepes調節ph。從某些樣品（尤其是組織）中提取的dna中可能包含一些膠狀不溶物，可》12000×g離心10分鐘除去。
dna的定量
取一份溶於8mmnaoh的dna加水測a260值。一單位a260值相當於50μg/ml雙鏈dna。理論上，人、大鼠、小鼠1×106二倍體細胞含dna的量約分別為7.
1μg,6.5μg,5.8μg。
分離dna的應用
1．用於pcr 溶於8mmnaoh的dna用0.1mhepes調ph至8.4,取0.1-1μgdna用作pcr模板。
2．酶切反應 用hepes或1mmedta調節ph至適當值。每μgdna使用3-5單位的酶,酶用量為3-5 iv/mgdna。
dna分離注意事項
1．dna在中間層和有機相中時可在2-8℃儲存過夜。
2．dna沉澱在75%乙醇中2-8℃可儲存數月。
3．dna在8mmnaoh溶液中4℃可放置過夜，如長期儲存需用hepes調節ph至7-8並且加edta至1mm可置於4℃或-20℃長期儲存。
dna的分離常見問題分析
得率低a.樣品勻漿和裂解的不徹底
b.最終得到的dna沉澱沒有完全溶解
a260/a280<1.70
a.檢測吸光度時，rna樣品沒有溶於水，而溶於了te中
b.酚除去不徹底，可用0.1m檸檬酸鈉（含10%乙醇）再洗一遍dna沉澱。
dna降解
a.組織取出後沒有馬上處理或冷凍
b.待提取rna的樣品沒有儲存於-60至-70℃,而儲存在了-5至-20℃
c.樣品勻漿時使用了高速勻漿儀
rna汙染
a.氯仿分層後水相未完全去除
b.dna沉澱用0.1m檸檬酸鈉（含10%乙醇）洗脫不徹底
蛋白質的分離
準備試劑
異丙醇、含0.3m鹽酸胍的95%乙醇、無水乙醇、1%sds
操作步驟
1．取沉澱dna後剩餘的上清，用異丙醇沉澱蛋白質。每使用1mltyphon加1.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘，2-8℃12000×g離心10分鐘棄上清。
2．用含0.3m鹽酸胍的95%乙醇洗滌蛋白質沉澱。每使用1mltyphon加2ml洗滌液，室溫放置20分鐘，2-8℃7500×g離心5分鐘，棄上清，重複兩次。
用2ml無水乙醇同樣方法再洗一次。
3．真空抽乾蛋白質沉澱5-10分鐘，用1%sds溶解蛋白質，反覆吸打，50℃水浴使其完全溶解，不溶物2-8℃10000×g離心10分鐘除去。分離得到的蛋白質樣品可用於westernblot或-5--20℃儲存備用。
蛋白質的提取注意事項
1．蛋白質沉澱可儲存在含0.3m鹽酸胍的95%乙醇或無水乙醇中2-8℃一個月以上或-5--20℃一年以上。
2．用0.1%sds在2-8℃透析三次，10000×g離心10分鐘取上清即可用於western blot。
蛋白質的提取常見問題分析
得率低：
a.樣品裂解或勻漿處理不徹底
b.最後得到的蛋白質沉澱未完全溶解
蛋白質降解：
組織取出後沒有馬上處理或冷凍
電泳時條帶變形：
蛋白質沉澱洗滌不充分
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