1樓：匿名使用者
現在的市面上買的抗體很少是識別空間表位的
一般都是識別蛋白質一段保守的特異的氨基酸序列這個就足夠了
所以sds-page變性了之後還是能識別的
2樓：
誰說抗體都是識別空間表位的？
sds-page用的抗體就是識別線性表位的嘛
3樓：匿名使用者
一抗一般都是識別的氨基酸序列的
製作一抗時，就是把所要的蛋白質進行原核表達，表達完之後可以用柱子或磁珠進行純化，這種方法一般成本比較高。
還有一種方法就是把原核表達完的菌液收集菌體，超聲破碎，然後全部跑電泳（sds-page），之後用kcl染色（不是考染），將目的大小片段切下，用液氮研碎，加入pbs buffer，公司直接將這種糊狀的東西注射給兔子。大多數抗體公司都允許這樣做。
可見製作抗體時，抗原就已經變性了。
4樓：匿名使用者
多看看書吧。。。
雖然我做過多抗，也不是很瞭解原理。不過你說的什麼抗體都是識別空間表位的，那倒未必，因為我看到過是有識別線性表位的。而且我們跑了sds-page之後切膠免疫家兔，明顯都是變性過後的。
而且據我所知，現在有的公司做的抗體都是用某個蛋白n-或者c-端比較保守的幾個氨基酸序列，通過合成這幾個氨基酸，與bsa還是什麼結合（不好意思，本科畢業都3年了，說錯不負責啊），不過那個大分子好像是免疫原性比較低，我覺得那幾個氨基酸也不可能會有正確的如原來蛋白的空間表位吧。
小木蟲我不怎麼上。多去丁香園吧。不過我畢業後也再沒上過了。我本科畢業的時候倒是經常去中國生命科學論壇，現在好冷清啊。喜歡丁香園，哈哈。
western blot出現很多雜帶，求助，交流
5樓：武漢博歐特生物
1.因為wb的一抗識別的蛋白質的表位是順序表位，不是空間表位，所以wb狀態下的抗原-抗體識別，與非變性的生理條件下的抗原-抗體識別不同。
2.wb之前，先用分子篩純化同時也是檢測一下目的蛋白產物是否成功。也就是目的蛋白是否成功表達了，而且在提取後穩定存在了。
3.非特異性的條帶分子量偏大可能是sds page出的問題，膠的濃度不合適或者樣品溶解度不夠或者電泳時間不合適等，造成了目的條帶的表觀質量變大。
4.三個非特異性的分子量偏大條帶之一可能是目的蛋白在sds page出的問題出了問題，另外兩個帶可能本來就是雜帶了。可以**後對三條帶用質譜檢測精確的分子量加以確定。
5.三個非特異性的分子量偏大條帶至少應該有雜帶，雜帶出現而且與一抗相互作用，那麼只能說雜帶的順序表位也能被一抗識別，必須更換專一性更高的抗體。
6.還有考慮你的鎳柱親和分離的問題，是不是獲得了你的需要的目的蛋白質。
western blot 為什麼要用二抗?直接標記一抗不行嗎？
6樓：螞蟻
之所以用二抗，是因為二抗是帶有酶標的抗體，它跟一抗結合之後可以**顯影。如果你的一抗上面直接帶有酶標物，那可以不用二抗直接**。但是一般你的一抗都是少數應用的，廠家不會大批量生產，就不會費勁給它加酶標。
7樓：匿名使用者
一方面是為了顯影啥的 主要還是是為了增強特異性 放大訊號
免疫組化和westernblot的一抗有什麼區別
western blot中，封閉液封閉完成後，需要用pbs或pbst洗滌濾膜，然後進行一抗孵育
8樓：
封閉完可直接一抗孵育 一抗完了用pbst洗三次後二抗孵育 離子濃度肯定會對抗體結合有影響啦
9樓：匿名使用者
就是洗疊氮鈉和非特異結合的一抗的，磷酸鹽只是緩衝環境，當然有人不喜歡用pbst洗，有人用tbst洗，就是一個磷酸鹽緩衝環境和tris的緩衝環境而已，個人喜好。
10樓：匿名使用者
一抗孵育完成後洗膜是為了洗掉未和膜結合的抗體，而不是磷酸鹽。只有洗乾淨非特異性結合在膜上的一抗，加二抗時才不會因非特異結合而呈現很重的背景。至於是使用pbs(t)還是tbs(t)，這要具體看你的二抗種類。
pbs不適合ap系列,pbs/tbss適合ap和hrp體系。另外,做磷酸化蛋白的wb,pbs不合適.
11樓：天箭
一抗孵育完了要用pbst或tbst洗掉未結合抗原的一抗，一抗不洗乾淨顯色以後背景會很重。
12樓：百浩生物
有可能你看錯了，就一般的理解，是沒有必要的，tbst並不是洗磷酸鹽。或者二抗是ap標記的才要洗磷酸鹽。
hrp標記的二抗，就算是用pbst洗，也是可以的。因為二抗可以用pbs稀釋。洗去pbs是沒有意義的。
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