1樓：漫聊聊
請問我提取了不同日齡小白鼠的細胞rna，兩次提取的總rna用10uldepc稀釋，分光光度計1：50稀釋倍數測定rna濃度分別為770ug/ml,80ug/ml.因為後者rna濃度低我在反轉錄時多加了一點rna和反轉錄酶，反轉錄後得到dna，rna濃度為80ug/ml的直接測定了dna含量為114ug/ml.
然後做了realtime pcr,除目的帶外產生一條非特意帶，將rna濃度為770ug/ml得到的dna稀釋5倍測了單鏈dna含量為53ug/ml，做定量沒有非特意帶，請問各位我這條非特意帶產生的原因是因為rna濃度低嗎？但反轉錄後單鏈dna含量和濃度高的rna得到的dna稀釋5倍含量也差不多啊，請高手指點
2樓：怪物青瞳
你說的實驗應該是rt-qpcr，這個實驗的主要目的就是檢測rna的含量的，所以一開始其實是很難給出一個具體的值的。
通常建議根據所用的逆轉錄酶每個反應的rna的量的大致需求，先完成逆轉錄反應，例如，下面就列出了某一種逆轉錄酶要求的模板範圍。逆轉錄酶越好，這個範圍就會越寬，主要是可以用的rna量就可以更少。
total rna——1 pg - 5 μgpoly(a) rna —— 0.1 pg - 500 ngspecific rna —— 0.01 pg - 500 ng等到將rna都逆轉錄為cdna後，再進行qpcr的實驗。
這時候可以將cdna稀釋幾個梯度，以獲得理想的cq值。
3樓：人過中年
qpcr有兩個重要的引數，第一個引數是擴增曲線。圖四為擴增曲線表示形式，橫座標代表迴圈數，縱座標代表熒光強度或者相對熒光強度。反應開始時，熒光訊號不穩定，呈現波動狀態，隨後訊號會趨於穩定並且呈現指數性增長，到達一定迴圈數之後，熒光訊號強度不再增加，持續穩定。
擴增曲線展現出來為一條s型曲線，包括：基線期，指數擴增期，平臺期。反應完成後，qpcr儀會以基線期熒光訊號標準偏差的10倍生成一條閾值線，閾值線與擴增曲線產生交點，交點對應的橫座標代表ct值，ct值的含義代表每一個反應體系中熒光訊號強度達到閾值時經歷的擴增迴圈數，其本質不難看出就是迴圈數，它是熒光定量中唯一用於後續計算的數值，是後續定量計算的基礎。
4樓：因為你我會熱愛
提取rna測濃度時
a260/a280
大於3的原因可能是降解。
2、一般對於dna,純淨的時候比值是1.8，而對於rna則是接近2.0。
如果超過這個值，那麼最有可能的就是核酸降解了，因為寡聚的核酸和核苷酸在260的吸收峰比長鏈核苷酸要大，所以會使比值上升。
在有負外部性時，從私人角度看，市場調節是有利的，但從社會角度看，不是資源配置最優。這就是外部性引起的市場失靈。
外部性又稱外部效應，指某種經濟活動給與這項活動無關的主體帶來的影響，這就是說，這些活動會產生一些不由生產者或消費者承擔的成本（稱為負外部性），或不由生產者或消費者獲得的利益（稱為正外部性）。
在有負外部性時，社會邊際成本大於私人邊際成本，但私人邊際利益與社會邊際利益仍然相同，所以，當私人邊際成本=私人邊際利益時，社會邊際成本大於社會邊際利益。這時，從私人角度看，市場調節是有利的，但從社會角度看，不是資源配置最優。這就是外部性引起的市場失靈。
例如，建在河邊的工廠排出的廢水汙染了河流對他人造成損害。工廠排廢水是為了生產產品賺錢，工廠同購買它的產品的顧客之間的關係是金錢交換關係，但工廠由此造成的對他人的損害卻可能無需向他人支付任何賠償費。
這種影響就是工廠生產的外部影響。從私人來看資源配置最優，但從社會來看並不是資源配置最優。
做熒光定量pcr前要做總rna定量嗎
5樓：匿名使用者
一般提取組織後測rna的濃度，然後反轉錄的時候保證reaction mixture裡面rna的量是一樣的。然後你反轉錄成了cdna。這個時候不必要測濃度。
因為你的反轉錄體系都是一樣的，理論上講（建議用multipipetide）你生成的cdna也是一樣的
rt-pcr有兩種解釋，一是指real time-pcr，即實時pcr；另一種是指reverse transcription-pcr，即反轉錄pcr。要判斷文獻中所說的rt-pcr是指實時pcr還是指反轉錄pcr，可以看反應體系中的模板，如果是dna或cdna，那就是指實時pcr；
知道rna濃度，反轉錄時怎麼計算加的模板量呢 ，rna濃度單位是ng/ul 模板的加入量單位為ug，還有pcr也是ug
6樓：檢驗教研室
看你的結果，有幾種原因：1，模版濃度太低；2，上樣量太少；3，緩衝液有問題。你的rna濃度是1749.
91ng/ul ，也就是1.74ug/ul，因此加入1ul的rna也就差不多是1ug的量。
7樓：轟質譜打核磁
你用的rt-pcr試劑盒不會是專門為後續qrt-pcr設計的吧？如果這樣的話，還是用專門的定量跑，電泳跑的話效果肯定不好的。。。
8樓：匿名使用者
首先，你反轉錄是打算做什麼實驗？另外，反轉錄的產物跑普通的agarose膠沒有任何意義，每種nrna的長度都不同，反轉錄出來的產物也是長度不同的cdna，你看到的兩條比較明顯的條帶應該是18s和28s的帶，其它的應該是一片smear
9樓：
呵呵，還在糾結這個問題呢？
這樣告訴你吧，加1~10ug對實驗結果其實沒什麼影響，這是經驗之談。
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