1樓：匿名使用者
開機順序：先開電腦，待電腦完全啟動後再開啟定量pcr儀主機，等主機面板 上的綠燈亮後即可開啟定量pcr的收集軟體，進行實驗。
關機順序：確認實驗已經結束後，首先關閉訊號收集軟體，然後關掉定量pcr儀主機的電源，最後關閉電腦。
實時熒光定量pcr儀，由熒光定量系統和計算機組成，用來監測迴圈過程的熒光。與實時裝置相連的計算機收集熒光資料。資料通過開發的實時分析軟體以圖表的形式顯示。
原始資料被繪製成熒光強度相對於迴圈數的圖表。
原始資料收集後可以開始分析。實時裝置的軟體能使收集到的資料進行正常化處理來彌補背景熒光的差異。正常化後可以設定域值水平，這就是分析熒光資料的水平。
擴充套件資料
主要操作流程：
1、針對目的基因序列選擇合適的擴增片斷，設計引物。dna引物長度：15-25 個鹼基gc含量：
50%左右如果引物的與at區域富集結合，可以考慮用lna替換幾個鹼基，較少引物的長度以及避免引物次級結構和3’端二聚體的影響.由於引物和模板和探針與靶點之間的分之間的相互競爭，分之內雜交。
倒轉重複等等會引起引物的引發探針對結合效率達降低，因此我們選擇引物二聚體的△g為負值，即：<10 kcal/mol.沒有連續的g/c。
引物探針的儲存一般遵循以下原則：正向和反向引物儲存在-20度，濃度為10mm 或者10×工作濃度.探針應該避光儲存，貯存在-70度，最好以凍乾粉狀態，工作濃度的液體儲存一般兩週左右。
2、輸入靶序列，用進行比對；
3、檢查比對序列的多型性以及可能的錯誤避免這些區域來進行引物和探針設計；
4、在靶序列中避免直接待重複區，在重複區進行雜交容易使得引物非獲得產物性結合，降低dna的擴增效率以及減少分析的靈敏度；
5、考慮到潛在的剪接變異體以及合適的所需要的獲得到靶，通過學分析內含子以及外顯子的邊界，主要通過cdna和基因組序列比對來確定。一般都設計跨最長內含子區，這樣減少了擴增子受到基因組dna的汙染的影響。這是十分有必要的，特別當用dna做歸一化處理以及靶向某一特異的剪接變異體。
最經濟的做法是讓下游引物跨越剪接接頭，這樣允許使用一條探針檢測可能剪接變異體.然後如果在有效性和靈敏度無法保證情況下，可以使用跨越單一外顯子的設計方案。我們還是建議試驗者用dnasei處理樣品，除去gdna的汙染；
6、在rt步驟時，用工具檢測在特定溫度下靶序列的摺疊情況，避免一些高度次級結構的區域，那些區域探針和引物結合效率較低。
2樓：揮劍晶
按照正確的開關機順序操作，有助於延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。開機順序：先開電腦，待電腦完全啟動後再開啟定量pcr儀主機，等主機面板 上的綠燈亮後即可開啟定量pcr的收集軟體，進行實驗。
關機順序：確認實驗已經結束後，首先關閉訊號收集軟體，然後關掉定量pcr儀主機的電源，最後關閉 電腦。
如何作qpcr的標準曲線
3樓：夏娃的夏天
作qpcr的標準曲線可以用pcr－elisa法作。
具體如下：
pcr－elisa法：
利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合；
再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。
常規的pcr－elisa法只是定性實驗，加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。
通過測定一系列已知組分的標準物質的某理化性質，從而得到該性質的數值所組成的曲線。
擴充套件資料：
實時熒光定量pcr技術，在pcr反應體系中加入熒光基團，利用熒光訊號積累實時監測整個pcr程序，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
檢測方法：
1、sybrgreenⅰ法：
在pcr反應體系中，加入過量sybr熒光染料，sybr熒光染料特異性地摻入dna雙鏈後，發射熒光訊號。
而不摻入鏈中的sybr染料分子不會發射任何熒光訊號，從而保證熒光訊號的增加與pcr產物的增加完全同步。
sybr定量pcr擴增熒光曲線圖、pcr產物熔解曲線圖（單一峰圖表明pcr擴增產物的單一性）。
2、taqman探針法：
探針完整時，報告基團發射的熒光訊號被淬滅基團吸收；
pcr擴增時，taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光訊號。
即每擴增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光訊號的累積與pcr產物的形成完全同步。
pcr反應的前15個迴圈的熒光訊號作為熒光本底訊號，熒光閾值的預設（預設）設定是3-15個迴圈的熒光訊號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10*sdcycle 3-15。
利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫座標代表起始拷貝數的對數，縱座標代ct值。因此，只要獲得未知樣品的ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
熒光定量pcr的操作步驟
4樓：小顏
熒光定量pcr 實驗步驟： ①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。
②兩相分離 每1ml的trizol試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振盪管體15秒後，15到30℃孵育2到3分鐘。
4℃下12000rpm離心15分鐘。離心後混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。rna全部被分配於水相中。
水相上層的體積大約是勻漿時加入的trizol試劑的60%。
③rna沉澱 將水相上層轉移到一干淨無rna酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉澱其中的rna，混勻後15到30℃孵育10分鐘後，於4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的rna沉澱將在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊。
④rna清洗 移去上清液，每1mltrizol試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用depch2o配製），清洗rna沉澱。混勻後，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤rna乾燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使rna沉澱在室溫空氣中乾燥5-10分鐘。
⑥溶解rna沉澱 溶解rna時，先加入無rna酶的水40μl用槍反覆吹打幾次，使其完全溶解，獲得的rna溶液儲存於-80℃待用。 1）紫外吸收法測定
先用稀釋用的te溶液將分光光度計調零。然後取少量rna溶液用te稀釋（1:100）後，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定rna溶液 濃度和純度。
① 濃度測定
a260下讀值為1表示40 μg rna/ml。樣品rna濃度(μg/ml)計算公式為：a260 ×稀釋倍數× 40 μg/ml。具體計算如下：
rna溶於40 μl depc水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的te中，測得a260 = 0.21
rna 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用來測量以後，剩餘樣品rna為35 μl，剩餘rna總量為：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②純度檢測
rna溶液的a260/a280的比值即為rna純度，比值範圍1.8到2.1。
2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定
①制膠1g瓊脂糖溶於72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× mops電泳緩衝液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 m)。
10×mops電泳緩衝液
濃度 成分
0.4m mops，ph 7.0
0.1m 乙酸鈉
0.01m edta
灌製凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝後取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×mops電泳緩衝液至覆蓋膠面幾個毫米。
②準備rna樣品
取3μgrna，加3倍體積的甲醛上樣染液，加eb於甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
③電泳上樣前凝膠須預電泳5min，隨後將樣品加入上樣孔。5–6v/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。
④紫外透射光下觀察並拍照
28s和18s核糖體rna的帶非常亮而濃（其大小決定於用於抽提rna的物種型別），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的rna（trna和5s核糖體rna）組成。在18s和28s核糖體帶之間可以看到一片彌散的eb染色物質，可能是由mrna和其它異型rna組成。
rna製備過程中如果出現dna汙染，將會在28s核糖體rna帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，rna的降解表現為核糖體rna帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。 ①反應體系 序號 反應物 劑量 1 逆轉錄buffer 2μl 2 上游引物 0.
2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dntp 0.1μl 5 逆轉錄酶mmlv 0.
5μl 6 depc水 5μl 7 rna模版 2μl 8 總體積 10μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
②混合液在加入逆轉錄酶mmlv 之前先70℃幹浴3分鐘，取出後立即冰水浴至管內外溫度一致，然後加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。
③取出後立即95℃幹浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cdna溶液，儲存於-80℃待用。 管家基因（β-actin）實時定量pcr
①β-actin陽性模板的標準梯度製備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl並充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應體系如下：
標準品反應體系 序號 反應物 劑量 1 sybr green 1 染料 10μl 2 陽性模板上游引物f 0.5μl 3 陽性模板下游引物r 0.5μl 4 dntp 0.
5μl 5 taq酶 1μl 6 陽性模板dna 5μl 7 ddh2o 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
管家基因反應體系： 序號 反應物 劑量 1 sybr green 1 染料 10μl 2 內參照上游引物f 0.5μl 3 內參照下游引物r 0.
5μl 4 dntp 0.5μl 5 taq酶 1μl 6 待測樣品cdna 5μl 7 ddh2o 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③製備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃2分鐘，然後93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個迴圈。 ①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cdna模板進行pcr反應。
反應體系： 序號 反應物 劑量 1 10×pcr緩衝液 2.5 ul 2 mgcl2溶液 1.
5 ul 3 上游引物f 0.5 ul 4 下游引物r 0.5 ul 5 dntp混合液 3 ul 6 taq聚合酶 1 ul 7 cdna 1 ul 8 加水至總體積為 25ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
35個pcr迴圈（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72℃延伸5分鐘。
②pcr產物與 dna ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測pcr產物是否為單一特異性擴增條帶。
③將pcr產物進行10倍梯度稀釋: 設定pcr產物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。 ①所有cdna樣品分別配置實時定量 pcr反應體系。
體系配置如下： 序號 反應物 劑量 1 sybr green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dntp 1ul 5 taq聚合酶 2ul 6 待測樣品cdna 5ul 7 ddh2o 30ul 8 總體積 50 ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
②將配製好的pcr反應溶液置於realtime pcr儀上進行pcr擴增反應。反應條件為：93℃2分鐘預變性，然後按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個迴圈，最後72℃7分鐘延伸。
各樣品的目的基因和管家基因分別進行realtime pcr反應。pcr產物與 dna ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，goldview染色，檢測pcr產物是否為單一特異性擴增條帶。
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