1樓：匡雅霜
pcr驗證時常呈假陽性，以酶切驗證為準。或者你可以送去測序。
2樓：匿名使用者
你可以送去測序看看 如果測序結果證明你的質粒對的話 ，可以更換酶切體系（質粒最好濃多點）、時間、如果還不行，就重新買內切酶試試吧 我當初就是切不出來後 換了體系，延長時間（過夜最佳）就有了，比較淡而已
3樓：匿名使用者
酶切體系是否合理，酶切時間是否足夠
4樓：花生梨
pcr非常靈敏，你做連線的時候連線產物就是目的片段和載體，轉化的時候連線產物混到感受態細胞裡，塗板的時候，那些沒連線進去的目的片段dna則存在於你的平板上，菌落上自然也有，而挑菌落的時候則把把這些dna帶到了試管或者三角瓶裡，提質粒的時候它們因為很短，自然不會被蛋白質細胞器基因組dna沉澱帶走，最後和陰性質粒一起再接受pcr，所以出了假陽性。
這也是為什麼菌落pcr的假陽性遠遠高於菌液pcr的原因，一般菌液pcr不容易遇到假陽性的，尤其做了藍白篩選或者用了帶有致死基因的克隆載體，不過送去測序之前都最好經過酶切確認。
挑克隆鑑定時pcr有目的條帶但是酶切沒有 50
5樓：匿名使用者
可能原因：
1.pcr擴增的是假克隆，因為pcr驗證的可靠性不穩定。
2.質粒中酶切位點變異
你可以做如下實驗：
1.看重組質粒的大小是不是比原始質粒大
2.用提出的質粒做pcr，這樣比較可靠，用細菌做pcr的假陽性極高3.用別的酶再試一下，是否能切出目的片段。
祝實驗成功
6樓：
2中可能，1種是你的抗生素失效了，長出來都是沒質粒的菌；另1種是你轉化進感受態的都是空質粒。
pcr擴增有目的條帶可能是因為連線產物殘留的pcr片段在平板上引起的假陽性。
7樓：匿名使用者
1)把提取的質粒和空質粒一起電泳 看是不是比空質粒大或者找一個質粒上的酶切位點酶切提取的質粒和原始質粒 再電泳觀察提取的質粒是否比原始質粒大
2)菌液pcr的假陽性經常出現 用質粒pcr擴增看是否有目的條帶3）最直接的辦法就是去測序了 一兩天的時間就出結果 一個反應二三十元 很方便
8樓：國際不配叫米蘭
單酶切切還是雙酶切??菌落pcr不是很準確,單酶切是應該只有一個目的條帶啊,你其額定酶是好的嗎??同意提質粒做pcr
重組質粒後為什麼還需要雙酶切，pcr鑑定並測序分析
9樓：匿名使用者
重組質粒是把載體質粒酶切開，連線上pcr片段，然後轉化感受態細胞，培養後提質粒獲得的，這一系列過程中都無法檢測目的基因是否連線成功了，是否轉化成功了，只有對轉化後的菌再次提質粒、酶切檢測或pcr檢測才能確定前邊的步驟是否成功。
測序是更準確的方法，一般不用而已。
菌落pcr會出現假陽性結果嗎
10樓：匿名使用者
高手們好。最近做酶切連線轉化，最後做鑑定時，以菌落為模板進行pcr時可以見到有目的條帶;當把菌落接種到lb液擴菌後，以菌液為模板進行pcr時卻什麼東東都沒有?請問會是什麼原因啊?
多多指教啊!建議重新以菌落為模板進行pcr檢測，再重新以菌液為模板進行pcr檢測，因為菌落或者菌液pcr假陽性的機率還是比較高的。但如果還是出現以上結果，推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的，此時建議再提質粒做pcr檢測和酶切檢測來徹底證明你的目的片段是否真正與載體連線成功。
個人的見解希望對你有所幫助，也期望高手們批評指正!我覺得菌落pcr效果很好，雖然有假陽性的可能，但是只要是做出來，有目的條帶一般是對的，你為什麼還要用菌液做pcr?你還不如搖菌後提取質粒然後用質粒pcr或者酶切。
既然你說到這個問題了，我覺得很有可能是你的質粒被稀釋了，因為在菌落中的濃度比較大。另外也有可能是你根本就沒有挑到正確的菌落來搖菌，所以就沒有質粒，怎麼能做出來。我覺得你做菌液的pcr和菌液的pcr必須是從單一的一個菌落挑出來的，如果不是，那肯定只有一個是正確的，我做過，只要是同一菌落不會有差錯。
你再試試看，祝你成功!謝謝各位高手的及時的回答。現在我都是挑單個菌落後搖菌，然後提取質粒，然後以質粒為模板做pcr，陽性的質粒再酶切進行鑑定，效果還可以。
再次謝謝大家!!!第二次看到這種觀點，不確定對不對，借道跟大家討論一下，不知道lcc有沒有文獻支援一下這種觀點?如果這種觀點正確，那我以前很多關於t載體的看法就錯了，所以很感興趣。
我一直以為外面的dn**段會被大腸桿菌分泌出來的核酸酶降解。 lcc_0 wrote:推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的說來也很奇怪，以前我就是挑菌後加到lb液後搖菌，然後以菌液為模板進行pcr，再以陽性管提取質粒進行酶切鑑定，排除陰性管，這樣可以少提一些質粒。
最近菌液pcr總是陰性，所以就直接提質粒進行鑑定了。其中原因真的不知道是什麼?我也遇到過，也許是塗抹的轉化產物導致的加陽性(菌落pcr)。
各位大大，我倒是碰到過菌液pcr是陰性，但是有質粒的情況，酶切也正確。一般我以為質粒抽屜和酶切鑑定是最保險的。pcr假陽性。
假陰性的概率都很高。菌液的問題在於鹽!鹽會干擾pcr。
如果用菌液的話，可以用水洗滌離心幾次，然後重懸於水，就可以了。 題外話:最近菌落pcr，陰性和陽性對照經常不擴增，而樣品擴增，鬱悶啊。
11樓：匿名使用者
條帶兩端上揚這種情況在跑電泳很常見，一般把電壓調低點跑久點會改善，有時候膠沒有做好也會出現這樣的情況，注意拔梳子的時候一定要平衡。以前做克隆的時候，陰性對照模板用水擴增也出現過有條帶，就像你最後一個泳道。老闆說是汙染了，把所有的試劑全部換新的，而且加樣條件也非常注意，後來就沒有條帶了。
12樓：匿名使用者
菌落pcr的結果參考價值比較下，假陽性太厲害。還是以測序結果為準。可以在測序之前做一下質粒酶切驗證
轉化後菌液pcr有目的條帶，然後提質粒和雙酶切驗證。但是沒有
劉家小妮兒 1.用水不會有太大影響，只是質粒在水中儲存不如在elution中穩定，最好還是用試劑盒的elution 2.你提的質粒是連有目的基因的話，可以空載在前，中間是marker，後邊重組質粒，一般如果目的基因比較小的話，不會有太多區別，可以雙酶切後看條帶數 重組質粒酶切後有兩條帶。3.一般酶切...
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