我想問做PCR擴增應該注意的事項

1樓：秒懂百科

pcr擴增：是體外酶促合成特異dn**段的一種方法

「rt-pcr擴增目的基因cdna」需要注意的事項有哪些?

2樓：朝顏_林西

rt-pcr 是將 rna 的反轉錄（rt）和 cdna 的聚合酶鏈式擴增（pcr）相結合的技術。

作用從 rna 合成 cdna，再以 cdna 為模板，擴增合成目的片段。

rt-pcr 技術靈敏而且用途廣泛，可用於檢測細胞中基因表達水平，細胞中 rna 病毒的含量和直接克隆特定基因的 cdna 序列。

作為模板的 rna 可以是總 rna、mrna 或體外轉錄的 rna 產物。無論使用何種 rna，關鍵是確保 rna 中無 rna 酶和基因組 dna 的汙染。

rna 的反轉錄過程遇到的問題

1．在實驗過程中要防止 rna 的降解，保持 rna 的完整性。在總 rna 的提取過程中，注意避免 mrna 的斷裂。

2．為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。

3．內參的設定：主要為了用於靶 rna 的定量。常用的內參有 g3pd（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-actin（β-肌動蛋白）等。

其目的在於避免 rna 定量誤差、加樣誤差以及各 pcr 反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

4． pcr 不能進入平臺期，出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標 dna 起始的數量有關。故對於每一個目標序列出現平臺效應的迴圈數，均應通過單獨實驗來確定。

5．防止 dna 的汙染：（1）採用 dna 酶處理 rna 樣品。

pcr實驗過程中的注意事項

3樓：

pcr產物的電泳檢測時間　　一般為48h以內，有些最好於當日電泳檢測，大於48h後帶型不規則甚至消失。

pcr反應的關鍵環節有①模板核酸的製備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④pcr迴圈條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

酶切分析：

根據pcr產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離後，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑑定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。　　分子雜交：分子雜交是檢測pcr產物特異性的有力證據，也是檢測pcr 產物鹼基突變的有效方法。

　　southern印跡雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記後做探針，與pcr產物雜交。此法既可作特異性鑑定，又可以提高檢測pcr產物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用於科研。

　　斑點雜交：將pcr產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用於pcr產物特異性鑑定及變異分析。　　氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉澱核酸。

提取的核酸即可作為模板用於pcr反應。一般臨床檢測標本，可採用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因遊離，直接用於pcr擴增。rna模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶k法，要防止rnase降解rna。

溫度與時間的設定：　　基於pcr原理三步驟而設定變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中採用三溫度點法，雙鏈dna在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火併結合到靶序列上，然後快速升溫至70～75℃，在taq dna 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。

對於較短靶基因(長度為100～300bp時)可採用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般採用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度taq dna酶仍有較高的催化活性)。

實驗操作注意事項儘管擴增序列的殘留汙染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉汙染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：

1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；

2. 使用一次性吸頭，嚴禁與pcr產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露於空氣中，避免氣溶膠的汙染；

3. 避免反應液飛濺，開啟反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體於管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌面；

4. 操作多份樣品時，製備反應混合液，先將dntp、緩衝液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免汙染，又可以增加反應的精確度；

5. 最後加入反應模板，加入後蓋緊反應管；

6. 操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證pcr反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性；

7. 儘可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由於加樣器最容易受產物氣溶膠或標本dna的汙染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少pcr操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是pcr產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區；

8. 重複實驗，驗證結果，慎下結論。

4樓：匿名使用者

主要是注意rna別降解了，還有就是加樣一定要精確