1樓：麼破1自我
20ul雙酶切體系和10ul雙酶切體系的區別：dna的量是3.5微升1、產物濃度不同
20ul雙酶切體系比10ul雙酶切體系產物的濃度高。
2、dna反應量不同
20ul雙酶切體系所含dna要比10ul雙酶切體系含有的dna多，進行雙酶切時所要切的dna量也不同。
研究中常用的雙酶切體系就是20ul雙酶切體系和10ul雙酶切體系，二者除了調配比例之外，所用的酶是相同的，所以反應溫度，酶切時間等等都差不多。
只有在需要**用於連線的時候才選取50ul體系的雙酶切體系，同時多增加dna含量。
2樓：
在進行pcr擴增時候，給引物兩端設計好酶切位點，一般說來，限制酶的 選擇非常重要，儘量選擇粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如bamhi，hindiii，提前看好各公司的雙切酶所用公用的buffer，以及各酶在公用buffer裡的效率。選好酶切位點後，在各個酶的兩邊加上保護鹼基。 雙酶切時間及其體系：
需要強調的是很多人建議酶切過夜，其實完全沒有必要，我一般酶切3個小時，其實1個小時已經足夠。應用大體系，如100微升。 純化問題：
純化pcr產物割膠還是柱式，我推薦柱式，因為割膠手法不準，很容易割下大塊的膠，影響純化效率。現在的柱式純化號稱可以祛除引物，既然如此，酶切掉的幾個鹼基肯定也會被純化掉了。所以，pcr產物和雙酶切產物的純化均可應用柱式純化。
我用的是takara的純化柱試劑盒 酶量的問題：以takara的為例，其對1單位酶的定義如下：在50 μl 反應液中，30℃溫度下反應1小時，將1 μg 的λdna完全分解的酶量定義為1個活性單位(u)。
而該酶濃度約為15單位/微升，在除外酶降解的 因素外，該酶可分解15μg的dna，而一般從1-4ml菌液提出的 dna約為3μg，而pcr純化後的產物（50體系）約為3μg，所以即便全部加進去，只要純化的 ***，酶切完全切得動。 2、酶切、**後的pcr產物與載體的連線 摩爾比的計算，很多人憑經驗也可以。但對於初學者從頭認真計算則 非常有必要。
**的載體片段：**的pcr產物片段=1：10 ，一般取前者0.
03pmol，後者取0.3pmol。 pmol為單位的dna轉換為為μg單位的dna：
（x pmoles×長度bp×650）/ 1，000，000 （注：長度bp×650是該雙鏈dna的分子量）所得數值即為μg，也可以直接用這個公式套.1pmol 1000bp dna=0.
66μg，如載體是5380bp，則0.03pmol為 0.03×5.
38×0.66=0.106524μg。
測dna濃度可以在專用機子上測，注意od值，一般約1.8-2.0.
另外，如果嫌麻煩，也可用marker進行估測，如marker2000，5微升的 marker每個條帶約50ng。 連線反應：takara的 連線酶上的 說明寫的過夜，而其對連線酶單位的定義為：
在20 μl的連線反應體系中，6 μg的λdna-hind iii的分解物在16℃下反應30分鐘時，有90%以上的dna段被連線所需要的酶量定義為1個活性單位（u）。而它的濃度為350 u/μl ，所以完全夠用。連線酶容易失活，注意低溫操作，最好在冰上。
時間3個小時足已。 3、轉化： a、全量（10 μl）加入至100 μl jm109感受態細胞中，冰中放置30分鐘。
b、42℃加熱90秒鐘後，再在冰中放置2分鐘。 c、加入890 μl amp陰性培養基，37℃振盪培養60分鐘。 取100μl鋪板。
也可離心後餘100μl 幾個非常重要的問題 1 做轉化的時候，進行酶連線反應時，注意保持低溫狀態，因為ligase酶很容易降解.為保險起見，一般連線3小時，16度. 2 對含有amp-resistence的質粒鋪板時，注意加amp時的溫度，溫度過高，會使克隆株無法篩選出來.
我的方法是培基高溫消毒後放在烤箱裡，烤箱一般溫度為55-60度，然後做的時候拿出來，這樣好掌握溫度。鋪板前後注意用吹風機吹乾 3對照的設立： 為驗證雙酶切是否成功，可做如下對照：
a 酶切反應時加各單酶分別切，兩管，用同一種buffer，跑膠，看單切的兩管是否成線性.如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功. 做轉化時，也要進行對照.
設4個： a.即拿雙酶切的質粒產物也進行連線反應，這個對照可進一步看雙酶切是否成功，如果長出克隆，說明很有可能只進行了單酶切，如沒長出克隆，則證明雙酶切成功，當然要保證感受態，培基，連線酶都'正常'的情況下.
b.酶切過的未進行連線反應的雙酶切產物，進行轉化，這一步可以證明是否有殘留的未被任何酶切的原始質粒 c.設原始質粒為對照，意為檢測整個操作過程中是否有誤.
d.amp陰性板上用同一批感受態細胞鋪板20微升足夠，檢測感受態狀況. 4.
所有的試劑切記低溫儲存.一步一個腳印.不要偷懶，圖省事最後卻更費事.
注意設立對照。 經pcr鑑定，克隆90%-100%的陽性率，所以在後面的 挑克隆中，我只挑選4個就足夠了。然後雙酶切鑑定，測序。
3樓：用智慧為你解答
根據模板濃度啊 如果濃度太低 比如模板就得加10ul 那肯定要更大的體系 還有就是需要**的用大體系 菌p這種只是要看一下的用小體系
4樓：匿名使用者
1、**pcr產物： 在進行pcr擴增時候，給引物兩端設計好酶切位點，一般說來，限制酶的 選擇非常重要，儘量選擇粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如bamhi，hindiii，提前看好各公司的雙切酶所用公用的buffer，以及各酶在公用buffer裡的效率。選好酶切位點後，在各個酶的兩邊加上保護鹼基。
雙酶切時間及其體系：需要強調的是很多人建議酶切過夜，其實完全沒有必要，我一般酶切3個小時，其實1個小時已經足夠。應用大體系，如100微升。
純化問題：純化pcr產物割膠還是柱式，我推薦柱式，因為割膠手法不準，很容易割下大塊的膠，影響純化效率。現在的柱式純化號稱可以祛除引物，既然如此，酶切掉的幾個鹼基肯定也會被純化掉了。
所以，pcr產物和雙酶切產物的純化均可應用柱式純化。我用的是takara的純化柱試劑盒 酶量的問題：以takara的為例，其對1單位酶的定義如下：
在50 μl 反應液中，30℃溫度下反應1小時，將1 μg 的λdna完全分解的酶量定義為1個活性單位(u)。 而該酶濃度約為15單位/微升，在除外酶降解的 因素外，該酶可分解15μg的dna，而一般從1-4ml菌液提出的 dna約為3μg，而pcr純化後的產物（50體系）約為3μg，所以即便全部加進去，只要純化的 ***，酶切完全切得動。 2、酶切、**後的pcr產物與載體的連線 摩爾比的計算，很多人憑經驗也可以。
但對於初學者從頭認真計算則 非常有必要。**的載體片段：**的pcr產物片段=1：
10 ，一般取前者0.03pmol，後者取0.3pmol。
pmol為單位的dna轉換為為μg單位的dna：（x pmoles×長度bp×650）/ 1，000，000 （注：長度bp×650是該雙鏈dna的分子量）所得數值即為μg，也可以直接用這個公式套.
1pmol 1000bp dna=0.66μg，如載體是5380bp，則0.03pmol為 0.
03×5.38×0.66=0.
106524μg。 測dna濃度可以在專用機子上測，注意od值，一般約1.8-2.
0.另外，如果嫌麻煩，也可用marker進行估測，如marker2000，5微升的 marker每個條帶約50ng。 連線反應：
takara的 連線酶上的 說明寫的過夜，而其對連線酶單位的定義為：在20 μl的連線反應體系中，6 μg的λdna-hind iii的分解物在16℃下反應30分鐘時，有90%以上的dna段被連線所需要的酶量定義為1個活性單位（u）。而它的濃度為350 u/μl ，所以完全夠用。
連線酶容易失活，注意低溫操作，最好在冰上。時間3個小時足已。 3、轉化：
a、全量（10 μl）加入至100 μl jm109感受態細胞中，冰中放置30分鐘。 b、42℃加熱90秒鐘後，再在冰中放置2分鐘。 c、加入890 μl amp陰性培養基，37℃振盪培養60分鐘。
取100μl鋪板。也可離心後餘100μl 幾個非常重要的問題 1 做轉化的時候，進行酶連線反應時，注意保持低溫狀態，因為ligase酶很容易降解.為保險起見，一般連線3小時，16度.
2 對含有amp-resistence的質粒鋪板時，注意加amp時的溫度，溫度過高，會使克隆株無法篩選出來.我的方法是培基高溫消毒後放在烤箱裡，烤箱一般溫度為55-60度，然後做的時候拿出來，這樣好掌握溫度。鋪板前後注意用吹風機吹乾 3對照的設立：
為驗證雙酶切是否成功，可做如下對照： a 酶切反應時加各單酶分別切，兩管，用同一種buffer，跑膠，看單切的兩管是否成線性.如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功.
做轉化時，也要進行對照. 設4個： a.
即拿雙酶切的質粒產物也進行連線反應，這個對照可進一步看雙酶切是否成功，如果長出克隆，說明很有可能只進行了單酶切，如沒長出克隆，則證明雙酶切成功，當然要保證感受態，培基，連線酶都'正常'的情況下. b.酶切過的未進行連線反應的雙酶切產物，進行轉化，這一步可以證明是否有殘留的未被任何酶切的原始質粒 c.
設原始質粒為對照，意為檢測整個操作過程中是否有誤. d.amp陰性板上用同一批感受態細胞鋪板20微升足夠，檢測感受態狀況.
4.所有的試劑切記低溫儲存.一步一個腳印.
不要偷懶，圖省事最後卻更費事.注意設立對照。 經pcr鑑定，克隆90%-100%的陽性率，所以在後面的 挑克隆中，我只挑選4個就足夠了。
然後雙酶切鑑定，測序。
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35豆豆 pcr產物酶切後不能判斷是否完全.質粒如果切下來的片斷不是很小,可以取少量進行電泳檢視條帶.如果沒有完全酶切,大條帶會出現單酶切的產物條帶. 你是不是要把雙酶切後的質粒與載體連線，而無論是pcr還是載體都無法通過電泳判斷是否酶切完全，所以不好進行連線呀？對於pcr產物一般會採取這樣的策略，...