1樓：浩渺煙然
構建基因組文庫的步驟
a 分離基因組dna；b 用超聲波或限制酶等進行基因組dna部分或完全降解；c 將降解物進行分級得到所需大小dn**段；d 將dn**段與載體連線(一般用λ噬菌體載體)；e 將重組體匯入宿主細胞；f 最後篩選鑑定重組子克隆。
建立基因組文庫的方法2—λ噬菌體基因組文庫 可插入較大片段，最大可達23kb
建立基因組文庫的其他方法：cosmid基因組文庫 yac基因組文庫 bac基因組文庫
基因文庫的質量標準：
重組克隆的總數不宜過大， 以減輕篩選工作的壓力；載體的裝載量最好大於基因的長度， 避
免基因被分隔克隆；克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區域, 以利克隆排序；克隆片
段易於從載體分子上完整卸下,重組克隆能穩定儲存、擴增、篩選
建立cdna文庫的基本步驟
(1)隔離總rna和淨化mrna (2)合成的雙鏈互補脫氧核糖核酸適合插入一個克隆載體(3)克隆cdna合適的向量(4)轉移到合適的宿主細胞的重組載體(5)篩查陽性克隆
cdna克隆的策略
(1)自身引導的第二鏈合成+同聚物加尾（2）cdna克隆方法的改進。尾隨第一鏈寡核苷酸（dc）允許使用寡核苷酸引物（ dg）將要開展的第二鏈（3）cdna的定向克隆
從基因文庫中篩選分離目的基因克隆(1)製備核酸探針進行雜交篩選(2) 製備抗體進行免疫雜交篩選(3)根據生物大分子間的相互作用篩選目的基因(4)利用pcr技術篩選目的基因文庫(5)利用噬菌體表面展示技術分離目的cdna克隆：噬菌體展示(phage display)：是在噬菌體表面表達已融合到噬菌體外殼蛋白的重組蛋白或多肽的技術。
應用噬菌體展示技術的關鍵是構建表達性基因文庫，這種文庫稱為噬菌體展示文庫(phage display library )。
常用的構建噬菌體顯示文庫的表達載體有兩類：絲狀噬菌體和以這些噬菌體複製起始序列為基礎構建的噬菌粒(phagemid)。
mrna差別顯示技術原理：
在 mrna3′端的 poly (a)5』上游的 2個鹼基只有 1 2種組合。與此相對應，共可人工合成12種不同的下游引物，用以反轉錄mrna 合成cdna第一條鏈。這種引物通常稱為3』端錨定引物，它由oligo-d t後面接上兩個鹼基 (如 5′t1 1 - 1 2 mn3′, m=g、c或 a; n=a、g、c或 t)構成。
這樣，每一種此類人工合成的寡核苷酸引物，都將能夠把總mrna群體的1/12分子反轉錄成mrna-cdna雜交分子。由此可知，使用5′t1 1 - 1 2 mn3′引物，可以將整個mrna群體在cdna水平上，分成大致相等的但序列結構不同的12份亞群體。
ddrt-pcr的主要步驟：
ⅰ.從不同發育階段或不同基因型的細胞群體中分離mrna，並以3'錨定引物作為反轉錄的引物，合成第一鏈cdna；ⅱ.用5'隨機引物和某個3'端錨定引物對擴增第一鏈(摻入32p-dntp)；ⅲ.
用dna變性測序膠分離擴增產物，x光片**後檢測差別條帶；ⅳ.**特異性差別條帶；ⅴ.用同一引物對擴增已**的dna條帶；ⅵ.
用northern，southern及測序法分析所得的條帶；ⅶ.以該dn**段做探針，篩選全長cdna或核基因。
dna插入誘變法分離目的基因
dna插入誘變法主要用於植物目的基因的克隆分離研究。其基本原理是，當一段特定的dna序列插入到植物基因的內部或其鄰近位置時，一般會誘導該基因發生突變形成突變體植株，或者在插入位置產生一個新的基因。 如果該dna插入序列是已知的，便可用它作為dna分子探針，從突變體植株的基因組dna文庫中篩選得到突變基因片段。
然後利用此突變基因片段製備探針，從野生型植株的基因組dna文庫中克隆出野生型的目的基因。這樣，插入的dna序列相當於在植物基因上貼了一張標籤，因此，dna插入誘變法又叫dna標籤法(dna tagging)。
差別雜交和減法雜交技術分離目的基因
差別雜交
構建了基因文庫後，如沒有任何可供選擇的探針進行篩選，或沒有任何有關目的基因的核苷酸序列資訊時，可以考慮用差別雜交法篩選目的基因片段。差別雜交(differential hybridization)也稱為差別篩選(differential screening)法。
特別適用於分離在特定組織中或發育的特定階段表達的基因以及受生長因子調控的基因，亦可有效地用來分離經特殊處理誘導表達的基因。
差別雜交的技術原理：有目的基因能正常表達和不能表達的兩個不同的細胞群體。
在這種情況下，分別製備兩種不同細胞群體的mrna提取物，其中一個群體含有一定比例的目的基因mrna ，另一個群體不含有目的基因mrna。
差別雜交的技術原理過程：
以這兩種總mrna(或是它們的cdna拷貝)為探針，分別對由表達目的基因的細胞群體構建的cdna文庫進行篩選。
當以目的基因表達的mrna群體為探針時，所有包含重組體的菌落都呈陽性反應，在x光底片上呈現黑色斑點;
而以目的基因不表達的mrna群體為探針時，除了含有目的基因的菌落外，其餘的所有菌落都呈陽性反應，在x光底片上呈現黑色斑點。
比較這兩種底片並對照原平板，變可以挑選出含有目的基因的菌落，供進一步研究用。
差別雜交法的侷限性：首先，差別雜交的靈敏度比較低，不適合低丰度mrna的目的基因的分離。其次，差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑑定大量的噬菌斑，是一項十分耗時耗力的工作；第三，差別雜交重複性差。
差別雜交涉及文庫的濾膜影印，不同濾膜之間的dna保有量往往不均一，雜交所得的訊號強度也會不一致，需要重新進行點雜交，以做進一步的陽性克隆鑑定工作 。
mrna減法雜交基本原理：從表達目的基因的組織中提取mrna並反轉錄成為cdna，然後與無目的基因表達的組織中提取的mrna做過量雜交，在兩種組織中均表達的基因產物形成程cdna/mrna雙鏈雜交分子，而特異mrna反轉錄的cdn**段仍然保持單鏈狀態，這種單鏈cdna分離出來即為差異表達的序列。
基因突變技術分為兩大類：位點特異性突變和隨機突變。位點特異性突變又分兩種型別：
一類是通過寡核苷酸介導的基因突變(oligonucleotide-mediated mutagenesis)；第二類是利用pcr,以雙鏈dna為模板所進行的基因突變。
寡核苷酸介導的定點誘變的原理
使用化學合成的含有突變鹼基的寡核苷酸片段作引物，啟動單鏈dna分子進行復制，隨後這段寡核苷酸引物便成了新合成的dna子鏈的組成部分。因此，所產生出來的新鏈便具有已發生突變的鹼基序列。要求所設計的寡核苷酸引物除了所需的突變位點之外，與目的基因編碼的區段完全互補。
作為誘變劑的寡核苷酸序列，同待誘變的目的基因的互補序列之間，能形成一種穩定的唯一的雙鏈結構。決定雙鏈區段穩定性的主要因素是鹼基的組分、核苷酸的錯配以及寡核苷酸引物的長度等。
寡核苷酸介導的定點誘變的基本步驟
(a)將要進行突變的目標基因(或dn**段)克隆於m13噬菌體載體或噬菌粒載體。(b)從重組的m13或噬菌粒中製備單鏈dna。(c)將設計好的寡核苷酸突變引物的5』端用t4多核苷酸激酶進行磷酸化。
(d)將上述突變引物與目標基因(單鏈的dna模板)進行退火。(e)在存在dna聚合酶和dntp的情況下，使退火引物沿單鏈dna模板延伸，然後新生鏈的末端用t4 dna連線酶連線。(f)轉染易感細菌。
(g)篩選出帶有突變的目標基因的噬菌斑。(h)從突變的重組噬菌體制備單鏈dna，通過dna序列分析確認突變位點的正確性。(i)從重組的m13噬菌體複製型雙鏈dna中**突變的目標基因(dn**段)。
(j)將突變了的基因(dn**段)重組入表達載體進行表達。
第五章受體細胞應具備的條件
(1)便於重組dna分子的匯入。如易形成感受態，具有較高的轉化效率；(2) 能使重組體dna分子穩定存在於細胞中。如限制性缺陷型； (3) 便於重組體的篩選。
如具有與重組體互補的遺傳性狀； (4) 受體細胞遺傳穩定性高，易於擴大培養或發酵生長，能進行高密度培養；對動物細胞要可懸浮培養，對培養基適應性要好；(5)安全性高，無治病性，不會對外界環境造成生物汙染：感染與寄生缺陷型；(6)蛋白水解酶少,利於外源蛋白在細胞內的積累。尤其是對枯草芽孢桿菌。
(7) 受體細胞的密碼子偏倚性要小；(8) 具有較好的翻譯後加工機制，便於真核目的基因的高效表達。 ▲糖蛋白不能在e.coli中表達；(9) 在理論研究和生產實踐上有較高的應用價值；(10)對於用於基因擴增或基因高效表達的受體要用重組整合缺陷型。
第六章克隆基因高表達的相關因素
1有效轉錄開始 關鍵的一步，並限制外源基因表達的一步！構建表達載體的同時，選擇強的和可控制的啟動子和相關終止序列。
2有效延長和終止轉錄正確 3 mrna的穩定性4有效地轉錄開始5遺傳密碼子偏向6核糖核酸處理過程7終止密碼子8表達載體9重組蛋白
lac 表達系統 以大腸桿菌 lac 操縱子調控機理為基礎設計、構建的表達系統
具有多順反子結構，基因排列次序為：啟動子（lacp）- 操縱基因（laco） - 結構基因（lacz-lacy-laca）；正調節因子 cap；負調節因子 lac i
tac 表達系統
tac啟動子是由 trp 的 –35 序列和 lacuv5 的 –10 序列拼接而成的雜合啟動子。
調控模式與 lacuv5 相似，但 mrna 轉錄水平高於 trp 和 lacuv5啟動子（p tac = 3 p trp = 11 p lac），因此在要求有較高基因表達水平的情況下，選用 tac 啟動子比用 lacuv5 啟動子更優越。
包涵體蛋白
在一定條件下，外源基因的表達產物在大腸桿菌中積累並緻密地聚集在一起，形成無膜的裸露結構，這種結構稱為包涵體(inclusion body, inclusive body)。
包涵體主要由蛋白質組成，並且大部分為外源基因的表達產物，它們具有正確的氨基酸序列，但構像卻是錯誤的，因而包涵體蛋白一般沒有生物學活性。
除此之外，包涵體中還含有少量的dna、rna和脂多糖等非蛋白分子。
包涵體形成的原因
主要因為在重組蛋白的表達過程中，缺乏某些蛋白質摺疊過程中需要的酶和輔助因子，或環境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。此外，還有以下原因：
(1)表達量過高。(2) 重組蛋白的氨基酸組成(3)重組蛋白所處的環境：溫度、ph(4)缺少真核生物中翻譯後修飾所需酶類(5)培養條件不佳
酵母基因表達載體的種類
自主複製型質粒載體:含酵母基因組的dna複製起始區、選擇標記和克隆位點等關鍵元件。較高拷貝數，細胞**時不能平均分配到子細胞中。
整合型質粒載體:不含酵母基因組的dna複製起始區，但含有整合介導區。
著絲粒型質粒載體:在自主複製型質粒載體基礎上構建而成，增加了酵母染色體有絲**穩定序列元件，可保證平均分配到子細胞中。1-2拷貝/細胞。
酵母人工染色體:以線性雙鏈dna形式存在於酵母細胞，每個細胞只有單拷貝。
為什麼要構建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內提取不行嗎
基因文庫技術分離目的基因 所謂文庫 1ibrary 是指一種全體的集合。基因文庫 gene library 則是指某一生物型別全部基因的集合。這種集合是以重組體形式出現。某生物dn 段群體與載體分子重組，重組後轉化宿主細胞，轉化細胞在選擇培養基上生長出的單個菌落 或噬菌斑 或成活細胞 即為一個dn ...
為什麼構建基因文庫？直接從生物體內提取不行嗎
當然不能直接提取。基因是一個人為概念，但從分子角度上看，基因與非基因沒有分子水平的差異。而我們要操作分子，必須找到目標靶序列。所以，不可能直接提取任何一個基因，只能通過探針或者其他方式找到基因，並作相應的處理。使之可以識別。另外，不同基因在體內的拷貝數和表達頻率差異都很大，例如指導胚胎髮育的基因在成...
基因組學的簡介，什麼是基因組？什麼是基因組學
什麼是基因和人類基因組計劃 現代遺傳學家認為，基因是dna 脫氧核糖核酸 分子上具有遺傳效應的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應的dna分子片段。基因位於染色體上，並在染色體上呈線性排列。基因不僅可以通過複製把遺傳資訊傳遞給下一代，還可以使遺傳資訊得到表達。不同人種之間頭髮 膚色 眼睛 鼻子等不同...