1樓：匿名使用者
。。。。。。
ligation的話連結成功了出菌落了就好啊， 沒有必要一定要需要在膠上看見， 或者是要pcr能看見的。
因為本身連結本身所需要的vector和insert的dna量就很小。 如果能看見的話那需要大含量的ligation， 沒有那個必要， 除非是你出現問題了。
可是即使是出現問題了， ligation技術本身的特點也註定不是肯定可以看得到產物的。 雖然我知道的確有人這麼作。
t4 ligation總的來說還是不錯的， 如果覺得不理想建議換幾種連結方式， 比如16度o.n啊， 比如4度o.n啊， 比如室溫3小時啊， 等等， 比較起來我覺得t4的ligation是相當好的了， 比快速的那種我個人經驗要穩定， 如果短期不容易成功推薦選on的那種ligation方式。
另外vec：ins的比例多換幾種， 多嘗試幾次總會成功的， 你ligation成功了就可以繼續了啊， 跟膠和pcr較什麼勁。
不知道你用的是哪種t4了， 我以上說的是promega的t4。 公司不一樣效率也有所差異是真的了。
2樓：匿名使用者
哪個公司的t4？ 你的連線體系裡atp含量多少？你的問題太籠統了啊
連線反應產物，是否可以直接做pcr模板？要不要先滅活其中的t4連線酶？
3樓：匿名使用者
這樣做實際上是不可行的，效率會很低。我以前也想你一樣試過。
原因：粘性末端相連的機會不大，而且要6個同時都相連，機會是呈指數級別下降的。而且如果直接做pcr的話，那些沒有連線或者部分連線的片段十個極大的干擾。
2個方案：既然酶切位點獨特，建議把a和f修改為直接可以和質粒互補的末端，連線後直接克隆。比做pcr的可能性要大。
或者先做ab， cd， ef連線，克隆後再做兩次abcd+ef連線。
4樓：
連線產物可以用來直接作為pcr的模板，我做過。不放心的話可以65度20分鐘處理一下。
我覺得這樣做是可行的。但是最終的pcr產物可能會有各種非特異性擴增，切膠**時要注意片段大小是否正確
5樓：匿名使用者
博凌科為-為你解答：理論上講，你可以這樣做，甚至可以直接做pcr而不用連線。這個其實和多對分段克隆基因的原理一樣，都是讓前一對引物的下游引物，和後一對引物的上游引物有一段互補序列。
這樣所獲得的pcr片段就是前一段的末端和後一段的前端就會有互補序列。但是問題是，這樣的前後序列一般有15個鹼基左右的互補序列，而酶切位點的互補序列太短。這個需要你把pcr反應的退火溫度降低。
來保證鹼基互補。
6樓：匿名使用者
你這個想法理論上講是可行的，但是實際操作起來就會存在很大的困難。小片段連線比較難做。根據你的敘述，最後連線好的片段約為200bp左右。
我建議你把這200bp的片段分成4段，即1，2，3，4段，合成有15個鹼基互補的4條引物，1與2，3與4做一次重疊延伸，然後以1與2，3與4的產物為模板，1和4為引物在做一次重疊延伸pcr，這樣就ok了，速度會很快的。分成4段是因為引物合成鹼基個數小於60個的，按正常收費，這樣節約成本。
那為什麼連線表達載體時沒將t4連線酶混進那個載體附帶的mix液中呢？
7樓：匿名使用者
因為不同的實驗會根據不同的插入片段選擇不同的連線酶，除了t4之外還有其他的dna連線酶。你需要檢視說明書，看看哪種buffer可以讓酶切效率達到最佳數值。當然如果是雙酶切的話，你可能需要上網查詢相應buffer了。
希望能夠幫到你！
8樓：
厄。。。什牌子的啊。。。我用的都是分開的哦。。。buffer，酶等等。。。沒有mix的呢。
如何增加t4 dna連線酶的連線效率
9樓：匿名使用者
加入peg8000，反應體系終濃度5%
10樓：smile我的愛人
buffer中加入鎂離子
我做連線，用swaⅰ酶切，平頭末端，用t4連線酶25度反應一小時，總是不成功，能給分析一下原因或有好的方法 10
11樓：匿名使用者
平頭連線本來就沒有粘性末端連線容易，一般我們永t4連線的話是16度過夜，成功率很高。也可4度冰箱放久點。說明書說25度也是可以的，我們一直沒有試過。
如果前面的實驗都正確的，建議採用16度水浴過夜
t4連線酶連線後產物怎麼處理？直接轉化嗎？
12樓：匿名使用者
加乙酸鈉和無水乙醇沉澱出來，70%酒精洗滌，再用te融解，再轉化
問：哪有參考的資料：
t4連線酶的說明書，takara的
13樓：匿名使用者
連線足夠時間
就可以做轉化了啊
這麼常規的技術，找個操作流程就好了，請問你還要什麼樣的參考資料？
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